Na základe stanovenia antivírusových protilátok v krvi pacienta pri sérologických reakciách pomocou špecifických vírusových antigénov - diagnostik alebo špeciálnych testovacích systémov. Sérologické reakcie na vírusové infekcie sa vykonávajú v kvapalnom médiu (RSK, RTGA, RNGA, RONGA, RTONGA, RIA), v géli (RPG, RRG, RVIEF) alebo na nosiči v pevnej fáze (napríklad na stenách jamka polystyrénovej platne s fixáciou jednej zo zložiek imunitnej odpovede - antigénu alebo protilátky). Také metódy na pevnej fáze, ako sú ELISA, IEM, RGadsTO, RIF, RGads, RTGads, sú známe.

Často kvôli prítomnosti väčšiny v krvi zdravých ľudí prírodné antivírusové protilátky, sérologická diagnostika vírusové infekcie na základe výskumu spárované séra, užívané na začiatku a uprostred ochorenia alebo počas obdobia rekonvalescencie, aby sa stanovil nárast titra protilátok. Zvýšenie titra protilátok na štyrikrát alebo viac sa považuje za diagnosticky významné.

Zvýšenie citlivosti sérologických metód sa dosahuje adsorpciou antigénov alebo protilátok na erytrocyty (RNGA, RONGA, RTONGA, RGadsTO, RRG), značením enzýmami (ELISA), rádioaktívnymi izotopmi (RIA, RPG) alebo fluorochrómmi (RIF), princíp lýzy erytrocytov sa tiež používa (systémy) pri interakcii antigénov a protilátok za prítomnosti komplementu (RSK, RRG).

Reakcia fixácie komplementu (CBC) ako variant väzby komplementu za studena (cez noc pri + 4 ° C) sa často používa vo virológii na retrospektívnu diagnostiku radu vírusových infekcií a na stanovenie vírusovo špecifických antigénov v materiáloch od pacientov.

Radiálna hemolýzová reakcia (RHR) v agarózovom géli je založený na fenoméne hemolýzy erytrocytov senzibilizovaných antigénom pod vplyvom vírusovo špecifických protilátok za prítomnosti komplementu a používa sa na sérologickú diagnostiku chrípkových, ARVI, rubeoly, mumpsu, togavírusových infekcií.

Na formuláciu reakcie sa 0,1 ml nezriedeného vírusového antigénu pridá k jahňacím erytrocytom (0,3 ml 10% suspenzie) a zmes sa udržuje 10 minút pri teplote miestnosti. 0,3 ml senzibilizovaných erytrocytov a 0,1 ml komplementu sa pridá k 1,2% agaróze pri teplote 42 ° C, zmes sa naleje na sklenené podložné sklíčka alebo do jamiek polystyrénových platní, otvory sa v mrazenom agarózovom géli vyrežú punč a naplnené vyšetrenými a kontrolnými sérami. Poháre alebo panely sú pokryté vekom a umiestnené do vlhkej komory na 16-18 hodín v termostate. Reakcia sa berie do úvahy priemerom zóny hemolýzy okolo otvorov naplnených sérom. V kontrole nie je hemolýza.

Sérologická diagnostika založená na reakcii antigén-protilátka môže byť použitá na stanovenie týchto aj ďalších, a hrá úlohu pri určovaní etiológie vírusovej infekcie dokonca aj s negatívne výsledky izolácia vírusu.

Úspech sérologickej diagnostiky závisí od špecifickosti reakcie a dodržania časových podmienok na odber krvi, ktoré sú nevyhnutné pre telo na syntézu protilátok.

Vo väčšine prípadov sa používajú spárované krvné séra, odobraté v intervaloch 2-3 týždňov. Za pozitívnu reakciu sa považuje najmenej 4-násobné zvýšenie titra protilátok. Je známe, že väčšina špecifických protilátok patrí do tried IgG a IgM, ktoré sa syntetizujú v rôznych časoch infekčného procesu. V tomto prípade protilátky IgM patria k včasným a testy používané na ich stanovenie slúžia na včasnú diagnostiku (stačí vyšetriť jedno sérum). Protilátky IgG sa syntetizujú neskôr a pretrvávajú dlho.

Na typovanie vírusov sa používa PH, na skupinovú diagnostiku, napríklad adenovírusovú infekciu, používajú reakcia fixácie komplementu(RSK). Najbežnejšie sú reakcia inhibície hemaglutinácie(RTGA), RSK, RIF, pasívna reakcia a reverzná pasívna hemaglutinácia(RPGA, ROPGA), rôzne verzie ELISA, ktoré takmer všade nahradili RIA, ktorá sa jej v citlivosti vyrovná.

RTGA používa sa na diagnostiku chorôb spôsobených hemaglutinačnými vírusmi. Je založená na väzbe séra pacienta na pridaný štandardný vírus. Indikátorom reakcie sú erytrocyty, ktoré aglutinujú s vírusom (tvorba charakteristického „dáždnika“) v neprítomnosti špecifických protilátok a usadia sa na dne neaglutinované, ak sú prítomné.

RSK je jedným z tradičných sérologických testov a používa sa na diagnostiku mnohých vírusových infekcií. Na reakcii sa zúčastňujú dva systémy: protilátky séra pacienta + štandardný vírus a baranie erytrocyty + protilátky proti nim, ako aj titrovaný komplement. Keď sa protilátky a vírus zhodujú, tento komplex viaže komplement a nedochádza k lýze ovčích erytrocytov (pozitívna reakcia). S negatívnym CSC komplement podporuje lýzu erytrocytov. Nevýhodou tejto metódy je nedostatočne vysoká citlivosť a obtiažnosť pri štandardizácii reagencií.

Aby sa zohľadnil význam CSC a RTGA, je potrebná titrácia párových sér, to znamená na začiatku ochorenia a počas rekonvalescencie.

RPGA- aglutinácia erytrocytov (alebo polystyrénových guľôčok) senzibilizovaných vírusovými antigénmi v prítomnosti protilátok. Na erytrocytoch je možné sorbovať akékoľvek vírusy bez ohľadu na prítomnosť alebo neprítomnosť hemaglutinačnej aktivity. Vzhľadom na prítomnosť nešpecifických reakcií sa séra študujú pri zriedení 1:10 alebo viac.

RNGA- aglutinácia erytrocytov senzibilizovaných špecifickými protilátkami v prítomnosti vírusových antigénov. Najrozšírenejšia ROPHA bola získaná, keď bol antigén HBs detegovaný u pacientov aj u darcov krvi.

AK metóda je tiež podobná ELISA, slúži na stanovenie protilátok v sére. ELISA na diagnostické účely je stále dôležitejšia a rozšírenejšia. Vírusový antigén je sorbovaný na pevnú fázu (dno jamiek polystyrénových platní alebo polystyrénových guľôčok). Keď sa pridajú zodpovedajúce protilátky prítomné v sére, viažu sa na adsorbované antigény. Prítomnosť požadovaných protilátok sa deteguje pomocou anti-protilátok (napríklad ľudských) konjugovaných s enzýmom (peroxidázou). Pridanie substrátu a reakcia substrát-enzým poskytnú farbu. Na stanovenie antigénov sa môže použiť aj test ELISA. V tomto prípade sú protilátky sorbované na pevnú fázu.

Monoklonálne protilátky. Veľký pokrok v diagnostike vírusových infekcií sa dosiahol v poslednom desaťročí, keď s rozvojom výskumu genetického inžinierstva bol vyvinutý systém na získavanie monoklonálnych protilátok. Špecifickosť a citlivosť sa teda výrazne zvýšili. diagnostické metódy stanovenie vírusových antigénov. Úzka špecificita monoklónov, predstavujúcich malú frakciu vírusových proteínov, ktoré nemusia byť prítomné v klinickom materiáli, je úspešne prekonaná použitím niekoľkých monoklonálnych protilátok proti rôznym vírusovým determinantom.

Antigény- geneticky cudzie látky, ktoré po zavedení do tela zvieraťa alebo človeka spôsobujú špecifickú imunitnú odpoveď - syntézu protilátok, tvorbu senzibilizovaných T -lymfocytov, imunologickú pamäť alebo toleranciu. Cudzie látky sa chápu ako chemické štruktúry, ktoré sa v tele nenachádzajú. Vírusy, mikroorganizmy, ako aj bunky, tkanivá, orgány zvierat a ďalšie osoby sú ľudskému telu cudzie. Antigény majú niekoľko receptorov na viazanie sa na protilátky a sú schopné s nimi reagovať v tele zvierat alebo ľudí (in vivo) aj mimo tela - v skúmavke (in vitro).

Protilátky- vysokomolekulárne proteíny globulínovej frakcie krvného séra. Protilátky sa syntetizujú pod vplyvom antigénu a sú schopné špecificky reagovať (kombinovať) so zodpovedajúcim antigénom. Všetky protilátky majú charakteristickú štruktúru imunoglobulínov; líšia sa imunologickými, biologickými a fyzikálnymi vlastnosťami; a sú rozdelené do 5 tried - IgG, IgA, IgM, IgD a IgE.

Sérologické reakcie

V laboratórnej praxi používajte sérologické reakcie- laboratórne reakcie medzi antigénmi a protilátkami, ktoré vedú k registrovaným zmenám v študovanom systéme. Tieto reakcie sa nazývajú sérologické, pretože používajú sérum (sérum) obsahujúce protilátky.

Sérologické testy vykonané na detekciu špecifických protilátok a antigénu patogénu v infekčné choroby, - viac dostupné metódy laboratórna diagnostika než bakteriologická identifikácia patogénu. V niektorých prípadoch zostávajú sérologické testy jedinou metódou na diagnostiku infekčných chorôb.

Niektoré metódy na stanovenie protilátok používané v laboratórnej praxi

Všetky sérologické reakcie sú založené na interakcii antigénu a protilátky s tvorbou imunitných komplexov, ktoré je možné detegovať v testoch in vitro (tj. „In vitro“ - mimo živého organizmu). Reakcie antigén -protilátka v systéme in vitro môžu byť sprevádzané výskytom niekoľkých javov - aglutinácia, zrážanie, lýza a ďalšie. Vonkajšie prejavy reakcie závisia od fyzikálno -chemických vlastností antigénu (veľkosť častíc, fyzikálny stav), triedy a typu protilátok, ako aj od experimentálnych podmienok (stredná konzistencia, koncentrácia soli, pH, teplota).

1. Reakcia väzbového komplementu

Doplnok je systém bielkovín krvnej plazmy, ktorý obsahuje 9 zložiek označených písmenom C (C1, C2, C3, ... C9), faktor B, faktor D a množstvo regulačných bielkovín. Niektoré z týchto zložiek sú zložené z 2-3 proteínov, napríklad C1 je komplex troch proteínov. Tieto proteíny cirkulujú v krvnom obehu a sú prítomné na bunkových membránach. Doplnok je najdôležitejším systémom vrodenej aj získanej imunity. Tento systém je navrhnutý tak, aby chránil telo pred pôsobením cudzích činidiel a podieľa sa na implementácii imunitnej reakcie tela. Doplnok objavil koncom 19. storočia belgický vedec J. Bordet.

Reakcia fixácie komplementu (CBC)- sérologický test používaný na kvantifikáciu protilátok a antigénov viažucich komplement. Prvýkrát ho opísali Bordet a Gengou v roku 1901. RSC je založená na skutočnosti, že komplex antigén-protilátka je schopný absorbovať komplement, ktorý sa pridá do reakčnej zmesi. Keď si antigény a protilátky navzájom zodpovedajú, vytvoria imunitný komplex, ku ktorému je pripojený komplement. Špecifický imunitný komplex adsorbuje komplement pridaný do systému, t.j. komplement je viazaný komplexom antigén-protilátka. Čím viac protilátok, tým viac komplementu je fixovaných. Ak sa komplex „antigén - protilátka“ nevytvorí, potom zostane komplement voľný.

Zložitosť CSC spočíva v tom, že reakcia na vznik komplexu „antigén - protilátka - komplement“ je neviditeľná. Na identifikáciu zložiek reakcie sa používa ďalší indikátorový hemolytický systém. S pomocou reakcie hemolýzy, kvantifikácia zvyšok komplementu po ukončení reakcie antigénu s antisérom.

Reakcia fixácie komplementu (CSC) sa používa na detekciu protilátok proti špecifickému antigénu alebo na určenie typu antigénu pomocou známej protilátky. Táto komplexná sérologická reakcia zahŕňa dva systémy a komplement. Prvý systém - bakteriologický (základný), pozostáva z antigénu a protilátky. Druhý systém je hemolytický (indikátor). Obsahuje ovčie erytrocyty (antigén) a zodpovedajúce hemolytické sérum (protilátka).

RSK sa uskutočňuje v dvoch krokoch: najskôr sa antigén spojí s testovaným krvným sérom, v ktorom sa hľadajú protilátky, a potom sa pridá komplement. Ak sa antigén a protilátka zhodujú, vytvorí sa imunitný komplex, ktorý viaže komplement. Pri absencii protilátok v sére sa imunitný komplex nevytvorí a komplement zostane voľný. Pretože proces adsorpcie komplementu komplexom je vizuálne neviditeľný, na detekciu tohto procesu je pridaný drahokamový systém.

Vďaka svojej vysokej citlivosti sa reakcia fixácie komplementu (CSC) používa ako na sérologickú diagnostiku bakteriálnych a vírusových infekcií, alergických stavov, tak na identifikáciu antigénov (izolovaná bakteriálna kultúra).

Zrážková reakcia (RP)(z latinčiny praecipitatio - zrážanie, padanie) je založené na vyzrážaní špecifického imunitného komplexu, pozostávajúceho z rozpustného antigénu a špecifickej protilátky v prítomnosti elektrolytu. V dôsledku reakcie sa vytvorí zakalený kruh alebo voľná zrazenina - zrazenina. K zrážacej reakcii dochádza medzi antigénom rozpustným vo vode a protilátkou, čím sa získajú veľké komplexy, ktoré sa vyzrážajú

3. Vločkovacia reakcia

Flokulačná reakcia (podľa Ramona)(z latinského floccus - vlnené vločky, vločky - kúsky, vločky; vločkovanie - tvorba voľných vločkovitých agregátov (vločiek) z malých častíc rozptýlenej fázy) - výskyt opalescencie alebo vločkovitej hmoty (imunoprecipitácia) v skúmavke počas reakčný toxín - antitoxín alebo toxoid - antitoxín. Slúži na stanovenie aktivity antitoxické sérum alebo toxoid.

Vločkovacia reakcia je založená na identifikácii „počiatočnej“ flokulácie - zákalu počas tvorby komplexu exotoxín (toxoid) + antitoxín v optimálnych kvantitatívnych pomeroch zložiek.

4. Reakcia aglutinácie

Aglutinácia(z lat. agglutinatio - adhézia) je reakcia interakcie antigénu so špecifickou protilátkou, ktorá sa prejavuje formou adhézie. V tomto prípade sú antigény vo forme častíc-krviniek (mikrobiálne bunky, erytrocyty atď.) Zlepené dohromady s protilátkami a vyzrážané (aglutinované) vo forme vločiek. Aglutináty sú zvyčajne viditeľné voľným okom. Na vznik reakcie je potrebná prítomnosť elektrolytov (napríklad izotonického roztoku chloridu sodného), ktoré urýchľujú proces aglutinácie.

Pomocou aglutinačného testu (RA) sa deteguje reaktio aglutinácia (anglický aglutinačný test), protilátky alebo korpuskulárne antigény. V závislosti od typu použitého imunodiagnostika sa rozlišuje reakcia mikrobiálnej aglutinácie, hemaglutinácie, latexaglutinácie, koaglutinácie atď.

5. Názov protilátok zapojených do sedimentárnych reakcií

Protilátky zapojené do sedimentárnych reakcií dostali svoj tradičný názov pre svoju interakciu s antigénom:

aglutiníny - spôsobujú adhéziu korpuskulárneho antigénu - aglutinogénu a vyzrážanie komplexu antigén - protilátka (aglutinát);

precipitíny - tvoria zrazeninu s rozpustným antigénom - precipitinogénom.

Lyzačné reakcie zahŕňajú bakteriolyzíny (spôsobujú lýzu baktérií) a hemolyzíny (spôsobujú lýzu erytrocytov).

Infekcia HIV
HIV infekcia je ochorenie spôsobené vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV), dlho pretrvávajúce v lymfocytoch, makrofágoch, bunkách nervového tkaniva, v dôsledku čoho pomaly progresívne poškodzuje imunitný a nervové systémy organizmus, prejavujúci sa sekundárnymi infekciami, nádormi, subakútnou encefalitídou a inými patologickými zmenami.
Pôvodcovia-vírusy ľudskej imunodeficiencie typu t a 2-HIV-1, HIV-2 (HIV-I, HIV-2, vírusy ľudskej imunodeficiencie, typy I, 11)-patria do rodiny retro vírusov, podrodiny pomalých vírusov ... Víriony sú sférické častice s priemerom 100 až 140 nm. Vírusová častica má vonkajší fosfolipidový obal, ktorý obsahuje určité glykoproteíny (štruktúrne proteíny) molekulová hmotnosť merané v kilodaltonoch. V prípade HIV-1 sú to gp 160, gp 120, gp 41. Vnútorný obal vírusu pokrývajúci jadro predstavujú aj proteíny so známou molekulovou hmotnosťou-p 17, p 24, p 55 (HIV-2 obsahuje gp 140, gp 105, gp 36, p 16, p 25, p 55).
Genóm HIV obsahuje RNA a enzým reverznej transkriptázy (reverznej transkriptázy). Aby sa retrovírusový genóm spojil s genómom hostiteľskej bunky, DNA sa najskôr syntetizuje na templáte vírusovej RNA pomocou reverznej transkriptázy. Potom sa provírusová DNA vloží do genómu hostiteľskej bunky. HIV má výraznú antigénnu variabilitu, výrazne vyššiu ako variabilita vírusu chrípky.
V ľudskom tele sú hlavným cieľom HIV T-lymfocyty, ktoré sa prenášajú na povrchu najväčší počet Receptory CD4. Potom, čo HIV prenikne do bunky pomocou revertázy, podľa vzoru svojej RNA, vírus syntetizuje DNA, ktorá je začlenená do genetického aparátu hostiteľskej bunky (T-lymfocyty) a zostáva tam celý život v provírusovom stave. Okrem T-pomocných lymfocytov sú ovplyvnené aj makrofágy, B-lymfocyty. bunky neuroglie, črevnej sliznice a niektorých ďalších buniek. Dôvodom poklesu počtu T-lymfocytov (bunky CD4) je nielen priamy cytopatický účinok vírusu, ale aj ich fúzia s neinfikovanými bunkami. Spolu s porážkou T-lymfocytov u pacientov s infekciou HIV dochádza k polyklonálnej aktivácii B-lymfocytov so zvýšením syntézy imunoglobulínov všetkých tried, najmä IgG a IgA, a k následnému vyčerpaniu tejto časti imunitného systému. systému. Zhoršená regulácia imunitných procesov sa prejavuje aj zvýšením hladiny alfa-interferónu, beta-2-mikroglobulínu a a znížením hladiny interleukínu-2. V dôsledku dysfunkcie imunitného systému, najmä keď počet T-lymfocytov (CD4) klesne na 400 alebo menej buniek v 1 μl krvi, vznikajú podmienky pre nekontrolovanú replikáciu HIV s výrazným zvýšením počtu viriónov v rôznych prostrediach tela. V dôsledku porážky mnohých častí imunitného systému sa človek infikovaný HIV stáva bezbranným voči patogénom rôzne infekcie... V lobby zvyšovania imunosupresie sa vyvíjajú závažné progresívne ochorenia, ktoré sa u človeka s normálne fungujúcim nevyskytujú imunitný systém... Tieto choroby definuje WHO ako marker (indikátor) AIDS.
Prvá skupina - choroby, ktoré sú vlastné iba závažnej imunodeficiencii (počet CD4 pod 200). Klinická diagnóza sa stanoví v neprítomnosti protilátok proti HIV alebo antigénov HIV.
Druhá skupina - choroby, ktoré sa vyvíjajú na pozadí ťažká imunodeficiencia, a v niektorých prípadoch bez neho. Preto je v takýchto prípadoch nevyhnutné laboratórne potvrdenie diagnózy.

Laboratórna diagnostika

UDC -078

Laboratórna diagnostika vírusových infekcií

N.N. Spout, V.M. Stachanov

Virologický ústav pomenovaný po DI. Ivanovský RAMS, Moskva

Laboratórna diagnostika vírusových infekcií

N.N. Nosik, V.M. Stachanova

Úvod

Rozširovanie príležitostí v liečbe a prevencii vírusových ochorení pomocou antivírusových liekov, imunomodulátorov a vakcín s rôznymi mechanizmami účinku vyžaduje rýchlu a presnú laboratórnu diagnostiku. Úzka špecifickosť niektorých antivírusových liekov tiež vyžaduje rýchlu a vysoko špecifickú diagnostiku infekčného agens. Na monitorovanie antivírusovej terapie sú potrebné kvantitatívne metódy na stanovenie vírusov. Okrem stanovenia etiológie ochorenia je laboratórna diagnostika dôležitá aj pri organizovaní protiepidemických opatrení.

Včasná diagnostika prvých prípadov epidemických infekcií umožňuje včasné zavedenie protiepidemických opatrení - karanténa, hospitalizácia, očkovanie atď. Implementácia programov na odstránenie infekčných chorôb, ako sú kiahne, ukázala, že pri ich implementácii zohráva úlohu laboratórnej diagnostiky sa zvyšuje. Laboratórna diagnostika v krvných službách a pôrodníckej praxi hrá zásadnú úlohu, napríklad pri identifikácii infikovaných darcov ľudský vírus nedostatočnej imunity(HIV), vírus hepatitídy B (HBV), diagnostika rubeoly a cytomegalovírusovej infekcie u tehotných žien.

Diagnostické metódy

K laboratórnej diagnostike vírusových infekcií existujú tri hlavné prístupy (tabuľka 1, tabuľka 2):

1) priame vyšetrenie materiálu na prítomnosť vírusového antigénu alebo nukleových kyselín;

2) izolácia a identifikácia vírusu z klinického materiálu;

3) sérologická diagnostika založená na stanovení významného zvýšenia vírusových protilátok v priebehu ochorenia.

Pri každom zvolenom prístupe k vírusovej diagnostike je jedným z najdôležitejších faktorov kvalita skúmaného materiálu. Napríklad na priamu analýzu vzorky alebo na izoláciu vírusu by sa testovací materiál mal získať na úplnom začiatku ochorenia, keď sa patogén stále vylučuje v relatívne veľkých množstvách a ešte nie je viazaný protilátkami, a objem vzorky by mal byť dostatočný na priamy výskum. Je tiež dôležité vybrať materiál v súlade s údajnou chorobou, to znamená materiál, v ktorom je na základe patogenézy infekcie pravdepodobnosť prítomnosti vírusu najväčšia.

Dôležitú úlohu v úspešnej diagnostike zohráva prostredie, v ktorom sa materiál odoberá, ako sa prepravuje a ako sa skladuje. Takže, nazofaryngeálne alebo rektálne stery, obsah vezikúl sa umiestni do média obsahujúceho proteín, ktorý zabraňuje rýchlej strate infekčnosti vírusu (ak sa plánuje jeho izolácia), alebo do vhodného pufra (ak je plánuje pracovať s nukleovými kyselinami).

Priame metódy diagnostiky klinického materiálu

Priame metódy sú metódy, ktoré detegujú vírus, vírusový antigén alebo vírus nukleová kyselina(NC) priamo v klinickom materiáli, to znamená, že sú najrýchlejší (2-24 hodín). Vzhľadom na množstvo zvláštností patogénov však priame metódy majú svoje obmedzenia (možnosť získať falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky). Preto často vyžadujú potvrdenie nepriamymi metódami.

Elektrónová mikroskopia (EM). Pomocou tejto metódy môžete zistiť skutočný vírus. Na úspešné stanovenie vírusu by mala byť jeho koncentrácia vo vzorke približne 1,06 častíc v 1 ml. Pretože je však koncentrácia patogénu v materiáli od pacientov spravidla nevýznamná, hľadanie vírusu je náročné a vyžaduje jeho predbežné vyzrážanie pomocou vysokorýchlostnej centrifugácie, po ktorej nasleduje negatívny kontrast. EM navyše neumožňuje písať vírusy, pretože mnohé z nich nemajú v rodine morfologické rozdiely. Vírusy herpes simplex, cytomegálie alebo herpes zoster sú napríklad morfologicky prakticky nerozlíšiteľné.

Jednou z variantov EM používaných na diagnostické účely je imunitná elektrónová mikroskopia(IEM), ktorý používa špecifické protilátky proti vírusom. V dôsledku interakcie protilátok s vírusmi sa vytvárajú komplexy, ktoré sú po negatívnych kontrastoch ľahšie detegovateľné.

IEM je o niečo citlivejšia ako EM a používa sa vtedy, keď vírus nemožno kultivovať in vitro napríklad pri hľadaní patogénov vírusovej hepatitídy.

Imunofluorescenčná reakcia (RIF). Metóda je založená na použití protilátok viazaných na farbivo, napríklad fluoresceín izotiokyanát. RIF sa široko používa na detekciu vírusových antigénov v materiáli pacientov a na rýchlu diagnostiku.

V praxi sa používajú dve možnosti RIF: rovno a nepriame... V prvom prípade sa aplikujú farbivom označené protilátky proti vírusom, ktoré sa aplikujú na infikované bunky (náter, bunková kultúra). Reakcia teda prebieha v jednom kroku. Nevýhodou tejto metódy je potreba mať veľkú sadu konjugovaných špecifických sér pre mnohé vírusy.

V nepriamej verzii RIF sa na testovaný materiál aplikuje špecifické sérum, ktorého protilátky sa viažu na vírusový antigén obsiahnutý v materiáli, a potom sa protidruhové sérum navrství na gama globulíny zvieraťa, v ktorom je bolo pripravené špecifické imunitné sérum, napríklad anti-králičie, anti-konské, atď. Výhoda nepriamej verzie RIF spočíva v potrebe iba jedného typu značených protilátok.

Metóda RIF sa široko používa na rýchle dešifrovanie etiológie akútnych respiračných vírusových infekcií pri analýze výtlačkov zo sliznice hornej časti dýchacie cesty... Úspešné použitie RIF na priamu detekciu vírusu v klinickom materiáli je možné len vtedy, ak obsahuje dostatočne veľký počet infikovaných buniek a nevýznamnú kontamináciu mikroorganizmami, ktoré môžu produkovať nešpecifickú luminiscenciu.

Enzýmovo viazaný imunosorbentný test (ELISA). Enzýmovo naviazané imunosorbenty na stanovenie vírusových antigénov sú v zásade podobné RIF, ale sú založené na značení protilátok skôr enzýmami než farbivami. Najpoužívanejšími sú chrenová peroxidáza a alkalická fosfatáza; používajú sa tiež -galaktozidáza a laktamázy. Značené protilátky sa viažu na antigén a takýto komplex sa deteguje pridaním substrátu pre enzým, ku ktorému sú protilátky konjugované. Konečný produkt reakcie môže byť vo forme nerozpustnej zrazeniny a potom sa registrácia vykoná pomocou konvenčného svetelného mikroskopu alebo vo forme rozpustného produktu, ktorý je zvyčajne zafarbený (alebo môže fluoreskovať alebo luminiscenčne) a sa zaznamenáva inštrumentálne.

Pretože ELISA môže merať rozpustné antigény, nie sú vo vzorke potrebné intaktné bunky, a preto je možné použiť rôzne typy klinického materiálu.

Ďalšou dôležitou výhodou metódy ELISA je schopnosť kvantifikovať antigény, ktorá ju umožňuje použiť na hodnotenie klinický kurz choroba a účinnosť chemoterapie. ELISA, podobne ako RIF, sa môže používať priamo aj nepriamo.

Najčastejšie sa používa test ELISA na tuhej fáze, ktorý poskytuje rozpustný farebný reakčný produkt. ELISA sa môže použiť na stanovenie antigénu (potom sa protilátky aplikujú na tuhú fázu - dno jamky polystyrénovej platne), ako aj na stanovenie protilátok (potom sa antigény aplikujú na pevnú fázu).

Rádioimunotest (RIA) ... Metóda je založená na značení protilátok rádioizotopmi, ktoré zaistili vysokú citlivosť pri určovaní vírusového antigénu. Metóda sa rozšírila v 80. rokoch, najmä na stanovenie markerov HBV a iných nekultivovateľných vírusov. Medzi nevýhody metódy patrí potreba pracovať s rádioaktívnymi látkami a používanie drahého zariadenia (gama počítadlá).

Molekulárne metódy. Vysoko špecifický spôsob hybridizácie NK bol spočiatku považovaný za klasický spôsob detekcie vírusového genómu, ale v dnešnej dobe sa izolácia vírusových genómov používa polymerická reťazová reakcia(PCR).

Molekulárna hybridizácia nukleových kyselín. Metóda je založená na hybridizácii komplementárnych reťazcov DNA alebo RNA s tvorbou dvojvláknových štruktúr a na ich identifikácii pomocou značky. Na tento účel sa používajú špeciálne sondy DNA alebo RNA označené izotopom (32 P) alebo biotínom, ktoré detegujú komplementárne reťazce DNA alebo RNA. Existuje niekoľko variantov metódy: - bodová hybridizácia - izolované a denaturované NC sa aplikujú na filtre a potom sa pridá označená sonda; indikácia výsledkov - autorádiografia pri použití 32 P alebo farbenie - avidín -biotínom; - blot hybridizácia - spôsob izolácie NK fragmentov rezaných reštrikčnými endonukleázami z celkovej DNA a prenesených do nitrocelulózových filtrov a testovaných označenými sondami; používa sa ako potvrdzujúci test na infekciu HIV; - hybridizácia in situ- umožňuje stanovenie NK v infikovaných bunkách.

PCR založené na princípe prirodzenej replikácie DNA. Podstata metódy spočíva v opakovanom opakovaní cyklov syntézy (amplifikácie) sekvencie DNA špecifickej pre vírus pomocou termostabilnej Taq DNA polymerázy a dvoch špecifických primérov-takzvaných primérov.

Každý cyklus pozostáva z troch fáz s rôznymi teplotnými podmienkami. V každom cykle sa počet kópií syntetizovanej sekcie zdvojnásobí. Novo syntetizované fragmenty DNA slúžia ako templát pre syntézu nových reťazcov v nasledujúcom amplifikačnom cykle, ktorý umožňuje 25–35 cyklov vygenerovať dostatočný počet kópií vybranej oblasti DNA na jej stanovenie, zvyčajne elektroforézou v agarózovom géli.

Metóda je veľmi špecifická a veľmi citlivá. Umožňuje vám detekovať viac kópií vírusovej DNA v testovacom materiáli. V posledných rokoch sa PCR stále častejšie používa na diagnostiku a monitorovanie vírusových infekcií (vírusy hepatitídy, herpesu, cytomegálie, papilómu atď.).

Bol vyvinutý variant kvantitatívnej PCR, ktorý umožňuje určiť počet kópií miesta amplifikovanej DNA. Táto technika je zložitá, drahá a zatiaľ nie je dostatočne štandardizovaná na rutinné používanie.

Cytologické metódy v súčasnej dobe majú obmedzenú diagnostickú hodnotu, ale stále by sa mali používať na množstvo infekcií. Skúmajú sa materiály pitvy, biopsie, sterov, ktoré sa po vhodnom spracovaní zafarbia a analyzujú pod mikroskopom. V prípade cytomegalovírusovej infekcie, napríklad v tkanivových rezoch alebo v moči, sa nachádzajú charakteristické obrovské bunky - „sovie oko“, v prípade besnoty - inklúzie v cytoplazme buniek (malé telá Babesha -Negriho). V niektorých prípadoch, napríklad pri diferenciálnej diagnostike chronickej hepatitídy, je dôležité posúdiť stav pečeňového tkaniva.