A vírusellenes antitestek meghatározásán alapul a páciens vérében szerológiai reakciókban, specifikus vírusantigének - diagnosztikai vagy speciális tesztrendszerek - felhasználásával. A vírusfertőzések szerológiai reakcióit folyékony közegben (RSK, RTGA, RNGA, RONGA, RTONGA, RIA), gélben (RPG, RRG, RVIEF) vagy szilárd fázisú hordozón (például a falakon) hajtják végre. polisztirol lemez mélyedése az immunválasz egyik komponensének - antigénnek vagy antitestnek - rögzítésével). Ismertek olyan szilárd fázisú módszerek, mint az ELISA, IEM, RGadsTO, RIF, RGads, RTGads.

Gyakran a többség vérében való jelenléte miatt egészséges emberek természetes vírusellenes antitestek, szerológiai diagnosztika vírusos fertőzések kutatások alapján párosított szérumok, a betegség kezdetén és közepén vagy a lábadozás időszakában az antitesttiter növekedésének meghatározására. Az antitesttiter négyszeres vagy nagyobb növekedése diagnosztikailag szignifikáns.

A szerológiai módszerek érzékenységének növelése az antigének vagy antitestek vörösvértesteken történő adszorpciójával (RNGA, RONGA, RTONGA, RGadsTO, RRG), enzimekkel (ELISA), radioaktív izotópokkal (RIA, RPG) vagy fluorokrómokkal (RIF) történő jelöléssel érhető el. Az eritrociták lízisének elvét (rendszerek) is alkalmazzák az antigének és antitestek kölcsönhatásában komplement (RSK, RRG) jelenlétében.

Komplement rögzítési reakció (CBC) A hidegben (egy éjszakán át + 4 °C-on) történő komplementkötés változataként gyakran használják a virológiában számos vírusfertőzés retrospektív diagnosztizálására és vírusspecifikus antigének meghatározására a betegektől származó anyagokban.

Radiális hemolízis reakció (RHR) Az agaróz gélben az antigénnel érzékenyített eritrociták hemolízisének jelenségén alapul, vírusspecifikus antitestek hatására komplement jelenlétében, és influenza, ARVI, rubeola, mumpsz, togavírus fertőzések szerológiai diagnosztikájára használják.

A bárány eritrocitákkal (0,3 ml 10%-os szuszpenzió) adott reakció elkészítéséhez adjunk hozzá 0,1 ml hígítatlan vírusantigént, és az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten tartjuk. 1,2%-os agarózhoz 42 °C-on 0,3 ml szenzitizált eritrocitát és 0,1 ml komplementet adunk, a keveréket tárgylemezekre vagy polisztirol lemezek üregeibe öntjük, majd a fagyasztott agaróz gélbe lyukakat vágunk. lyukasztjuk, és megtöltjük a vizsgált és kontroll szérummal. Az üvegeket vagy paneleket fedővel lefedjük, és 16-18 órára párás kamrába helyezzük termosztátban. A reakciót a szérummal töltött lyukak körüli hemolízis zóna átmérője veszi figyelembe. A kontrollban nincs hemolízis.

Az antigén-antitest reakción alapuló szerológiai diagnosztika mind ezek, mind mások meghatározására használható, és szerepet játszik a vírusfertőzés etiológiájának meghatározásában még akkor is. negatív eredményeket vírusizoláció.

A szerológiai diagnosztika sikere a reakció specifitásától és a vérvétel időfeltételeinek betartásától függ, amelyek szükségesek a szervezetben az antitestek szintéziséhez.

A legtöbb esetben párosított vérszérumot használnak, 2-3 hetes időközönként. Pozitív reakciónak az antitesttiter legalább 4-szeres növekedését kell tekinteni. Ismeretes, hogy a legtöbb specifikus antitest az IgG és IgM osztályokba tartozik, amelyek a fertőző folyamat különböző időpontjaiban szintetizálódnak. Ebben az esetben az IgM antitestek a koraiak közé tartoznak, és az ezek meghatározására szolgáló tesztek a korai diagnózishoz (elég egy szérum vizsgálata) szolgálnak. Az IgG antitestek később szintetizálódnak, és hosszú ideig fennmaradnak.

A vírusok tipizálására a PH-t, csoportspecifikus diagnosztikára, például adenovírus fertőzésre használják komplement rögzítési reakció(RSK). A leggyakoribbak a hemagglutináció gátló reakció(RTGA), RSK, RIF, passzív reakcióés fordított passzív hemagglutináció(RPGA, ROPGA), az ELISA különféle változatai, amelyek szinte mindenhol felváltották az érzékenységben vele egyenértékű RIA-t.

RTGA hemagglutináló vírusok által okozott betegségek diagnosztizálására szolgál. Ez a páciens szérumának a hozzáadott standard vírushoz való antitest-kötődésének alapja. A reakció indikátora az eritrociták, amelyeket a vírus agglutinál (jellegzetes "esernyő" képződése) specifikus antitestek hiányában, és ha jelen vannak, agglutinálatlanul ülepednek a fenékre.

RSK a hagyományos szerológiai tesztek egyike, és számos vírusfertőzés diagnosztizálására használják. A reakcióban két rendszer vesz részt: a páciens szérumának antitestei + standard vírus és kos eritrociták + ezek elleni antitestek, valamint a titrált komplement. Ha az antitestek és a vírus egyezik, ez a komplex megköti a komplementet, és nem megy végbe a birka eritrocitáinak lízise (pozitív reakció). Negatív CSC esetén a komplement elősegíti az eritrociták lízisét. Ennek a módszernek a hátránya a nem kellően magas érzékenység és a reagensek standardizálásának nehézsége.

A CSC-k, valamint az RTGA fontosságának figyelembevétele érdekében a párosított szérumok titrálása szükséges, azaz a betegség kezdetén és a lábadozás időszakában.

RPGA- vírusantigénekkel érzékenyített eritrociták (vagy polisztirol gyöngyök) agglutinációja antitestek jelenlétében. Bármely vírus felszívódhat az eritrocitákon, függetlenül a hemagglutináló aktivitás jelenlététől vagy hiányától. A nem specifikus reakciók jelenléte miatt a szérumokat 1:10 vagy annál nagyobb hígításban vizsgálják.

RNGA- specifikus antitestekkel érzékenyített eritrociták agglutinációja vírusantigének jelenlétében. A legelterjedtebb ROPHA-t akkor kaptuk, amikor a HBs antigént mind a betegekben, mind a véradókban kimutatták.

HA módszer is tetszik ELISA szérumban lévő antitestek meghatározására szolgál. Az EIA egyre nagyobb jelentőségű és diagnosztikai célú elterjedtté válik. A vírusantigén felszívódik a szilárd fázisra (polisztirol lemezek vagy polisztirol gyöngyök mélyedéseinek aljára). Amikor a szérumban jelenlévő megfelelő antitesteket hozzáadjuk, azok az adszorbeált antigénekhez kötődnek. A kívánt antitestek jelenlétét enzimhez (peroxidázhoz) konjugált antitestek (például humán) segítségével mutatják ki. A szubsztrát hozzáadása és a szubsztrát-enzim reakció színt ad. Az ELISA is használható antigének meghatározására. Ebben az esetben az antitestek felszívódnak a szilárd fázisra.

Monoklonális antitestek. A vírusfertőzések diagnosztizálásában nagy előrelépés történt az elmúlt évtizedben, amikor a géntechnológiai kutatások fejlődésével a monoklonális antitestek kinyerésére szolgáló rendszert fejlesztettek ki. Így a specificitás és az érzékenység meredeken megnövekedett. diagnosztikai módszerek a vírus antigének meghatározása. A monoklonok szűk specifitását, amelyek a vírusfehérjék kis hányadát képviselik, amelyek esetleg nincsenek jelen a klinikai anyagokban, sikeresen leküzdhetők a különféle vírusdeterminánsok elleni számos monoklonális antitest alkalmazásával.

Antigének- genetikailag idegen anyagok, amelyek az állat vagy ember szervezetébe kerülve specifikus immunválaszt váltanak ki - antitestek szintézise, ​​szenzitizált T-limfociták képződése, immunológiai memória vagy tolerancia. Az idegen anyagok olyan kémiai szerkezetek, amelyek nincsenek jelen a szervezetben. A vírusok, mikroorganizmusok, valamint az állatok és más emberek sejtjei, szövetei, szervei idegenek az emberi szervezet számára. Az antigének számos receptorral rendelkeznek az antitestekhez való kötődéshez, és képesek reagálni velük mind állati vagy emberi testben (in vivo), mind a testen kívül - kémcsőben (in vitro).

Antitestek- a vérszérum globulin frakciójának nagy molekulájú fehérjéi. Az antitestek egy antigén hatására szintetizálódnak, és képesek specifikusan reagálni (kombinálódni) a megfelelő antigénnel. Minden antitestnek jellegzetes immunglobulin szerkezete van; különböznek az immunológiai, biológiai és fizikai tulajdonságokban; és 5 osztályba sorolhatók - IgG, IgA, IgM, IgD és IgE.

Szerológiai reakciók

Laboratóriumi gyakorlatban használja szerológiai reakciók- az antigének és antitestek közötti laboratóriumi reakciók, amelyek a vizsgált rendszerben regisztrált változásokhoz vezetnek. Ezeket a reakciókat szerológiainak nevezik, mivel antitesteket tartalmazó szérumot (szérumot) használnak.

A kórokozó specifikus antitesteinek és antigénjének kimutatására végzett szerológiai vizsgálatok fertőző betegségek, - több elérhető módszerek laboratóriumi diagnosztika mint a kórokozó bakteriológiai azonosítása. Egyes esetekben a szerológiai vizsgálatok továbbra is az egyetlen módszer a fertőző betegségek diagnosztizálására.

A laboratóriumi gyakorlatban használt antitestek meghatározásának néhány módszere

Minden szerológiai reakció az antigén és az antitest kölcsönhatásán alapul az immunkomplexek képződésével, amelyek in vitro tesztekkel (azaz "in vitro" - élő szervezeten kívül) kimutathatók. Az antigén-antitest reakciókat az in vitro rendszerben számos jelenség - agglutináció, kicsapódás, lízis és mások - fellépése kísérheti. A reakció külső megnyilvánulásai az antigén fizikai-kémiai tulajdonságaitól (részecskeméret, fizikai állapot), az antitestek osztályától és típusától, valamint a kísérleti körülményektől (közepes konzisztenciától, sókoncentrációtól, pH-tól, hőmérséklettől) függnek.

1. Kötő komplement reakciója

Kiegészítés egy vérplazmafehérjék rendszere, amely 9 C betűvel jelölt komponenst (C1, C2, C3, ... C9), B faktort, D faktort és számos szabályozó fehérjét tartalmaz. Ezen komponensek egy része 2-3 fehérjéből áll, például a C1 három fehérje komplexe. Ezek a fehérjék a véráramban keringenek, és jelen vannak a sejtmembránokon. A komplement a veleszületett és szerzett immunitás legfontosabb rendszere. Ezt a rendszert úgy tervezték, hogy megvédje a szervezetet az idegen anyagok hatásától, és részt vesz a szervezet immunválaszának végrehajtásában. A komplementet a 19. század végén fedezte fel J. Bordet belga tudós.

Komplement rögzítési reakció (CBC)- a komplementkötő antitestek és antigének mennyiségi meghatározására szolgáló szerológiai teszt. Bordet és Gengou írta le először 1901-ben. Az RSC azon a tényen alapul, hogy az antigén-antitest komplex képes felszívni a komplementet, amelyet a reakcióelegyhez adnak. Amikor az antigének és az antitestek megfelelnek egymásnak, immunkomplexet alkotnak, amelyhez komplement kapcsolódik. Egy specifikus immunkomplex adszorbeálja a rendszerhez hozzáadott komplementet, pl. a komplementet az antigén-antitest komplex köti meg. Minél több antitest, annál több komplement rögzül. Ha nem jön létre az "antigén-antitest" komplex, akkor a komplement szabad marad.

A RAC összetettsége abban rejlik, hogy az "antigén - antitest - komplement" komplex képződésének reakciója láthatatlan. A reakció összetevőinek azonosításához további hemolitikus indikátorrendszert használnak. A hemolízis reakció segítségével mennyiségi meghatározása a komplement fennmaradó része az antigén és az antiszérum reakciója után.

A komplement fixációs reakciót (CSC) egy specifikus antigén elleni antitestek kimutatására vagy az antigén típusának meghatározására használják ismert antitest segítségével. Ez az összetett szerológiai reakció két rendszert és komplementet foglal magában. Az első rendszer - bakteriológiai (alap), egy antigénből és egy antitestből áll. A második rendszer hemolitikus (indikátor). Tartalmazza a birka vörösvértesteit (antigén) és a megfelelő hemolitikus szérumot (antitest).

Az RSK két lépésben történik: először az antigént kombinálják a vizsgált vérszérummal, amelyben antitesteket keresnek, majd komplementet adnak hozzá. Ha az antigén és az antitest egyezik egymással, akkor egy immunkomplex képződik, amely megköti a komplementet. Ha a szérumban nincsenek antitestek, az immunkomplex nem képződik, és a komplement szabad marad. Mivel a komplement komplex általi adszorpciós folyamata vizuálisan láthatatlan, egy gemrendszert adnak hozzá a folyamat észlelésére.

A komplement fixációs reakciót (CSC) nagy érzékenységének köszönhetően bakteriális és vírusos fertőzések, allergiás állapotok szerológiai diagnosztikájára, valamint antigének azonosítására (izolált baktériumtenyészet) egyaránt alkalmazzák.

Kicsapódási reakció (RP)(latin praecipitatio - kicsapódás, leesés) alapja egy specifikus immunkomplex kicsapása, amely egy oldható antigénből és egy specifikus antitestből áll elektrolit jelenlétében. A reakció eredményeként zavaros gyűrű vagy laza csapadék képződik - csapadék. A kicsapódási reakció a vízoldható antigén és az antitest között megy végbe, nagy komplexek keletkeznek, amelyek kicsapódnak.

3. A flokkulációs reakció

Flokkulációs reakció (Ramon szerint)(a latin floccus szóból - gyapjúpehely, pelyhesedés - aprítás, pelyhek; pelyhesedés - laza pelyhes aggregátumok (pelyhek) képződése a diszpergált fázis kis részecskéiből) - opálosodás vagy pelyhes tömeg megjelenése (immunprecipitáció) a kémcsőben a reakció toxin - antitoxin vagy toxoid - antitoxin. Az aktivitás meghatározására szolgál antitoxikus szérum vagy toxoid.

A pelyhesedési reakció a "kezdeti" flokkuláció azonosításán alapul - a zavarosság az exotoxin (toxoid) + antitoxin komplex képződése során az összetevők optimális mennyiségi arányában.

4. Agglutinációs reakció

Agglutináció(a latin agglutinatio szóból - adhézió) egy antigén és egy specifikus antitest kölcsönhatásának reakciója, amely adhézió formájában nyilvánul meg. Ebben az esetben a részecskék-testek (mikrobiális sejtek, eritrociták stb.) formájú antigének antitestekkel összeragasztanak, és pelyhek formájában kicsapódnak (agglutinálódnak). Az agglutinátumok általában szabad szemmel láthatók. A reakció megjelenéséhez elektrolitok (például izotóniás nátrium-klorid oldat) jelenléte szükséges, amelyek felgyorsítják az agglutináció folyamatát.

Az agglutinációs teszt (RA), a reactio agglutinationis (angol agglutinációs teszt) segítségével antitesteket vagy corpuscularis antigéneket mutatnak ki. Az alkalmazott immundiagnosticum típusától függően megkülönböztetik a mikrobiális agglutináció, hemagglutináció, latexagglutináció, koaglutináció stb. reakcióját.

5. Az üledékes reakciókban részt vevő antitestek neve

Az üledékes reakciókban részt vevő antitestek hagyományos elnevezésüket az antigénnel való kölcsönhatásukról kapták:

agglutininek - a corpuscularis antigén - agglutinogén - adhézióját és az antigén - antitest komplex (agglutinát) kicsapódását okozzák;

precipitins - csapadékot képez egy oldható antigénnel - precipitinogén.

A lízisreakciók közé tartoznak a bakteriolizinek (a baktériumok lízisét okozzák) és a hemolizinek (az eritrociták lízisét okozzák).

HIV fertőzés
A HIV-fertőzés a humán immundeficiencia vírus (HIV) által okozott betegség, hosszú idő limfocitákban, makrofágokban, idegszövet sejtjeiben perzisztáló, aminek következtében lassan progresszív immun- és idegrendszerek másodlagos fertőzések, daganatok, szubakut encephalitis és egyéb kóros elváltozások formájában nyilvánul meg.
A kórokozók a t és 2 típusú humán immundeficiencia vírusok - HIV-1, HIV-2 (HIV-I, HIV-2, Human Immunodeficiency viruses, Type I, 11) - a retrovírusok családjába, az alcsaládba tartoznak. lassú vírusoktól... A virionok 100-140 nm átmérőjű gömb alakú részecskék. A vírusrészecskének van egy külső foszfolipid burka, amely bizonyos glikoproteineket (strukturális fehérjéket) tartalmaz. molekuláris tömeg kilodaltonban mérve. A HIV-1-ben ezek a gp 160, gp 120, gp 41. A sejtmagot fedő vírus belső burkát szintén ismert molekulatömegű fehérjék képviselik - p 17, p 24, p 55 (a HIV-2 gp-t tartalmaz 140., 105., 36., 16., 25., 55. o.).
A HIV-genom RNS-t és egy reverz transzkriptáz (reverz transzkriptáz) enzimet tartalmaz. Annak érdekében, hogy a retrovírus genom kapcsolódjon a gazdasejt genomjához, először a DNS-t szintetizálják a vírus RNS-templátán reverz transzkriptáz segítségével. Ezután a provírus DNS-t beépítik a gazdasejt genomjába. A HIV kifejezett antigén variabilitással rendelkezik, ami jelentősen meghaladja az influenzavírusét.
Az emberi szervezetben a HIV fő célpontja a T-limfociták, amelyek a felszínen hordozzák magukat a legnagyobb számban CD4 receptorok. Miután a HIV reverz transzkriptáz segítségével behatol a sejtbe, RNS-ének mintázatát követve a vírus DNS-t szintetizál, amely beépül a gazdasejt genetikai apparátusába (T-limfocitákba) és ott marad egy életen át provírus állapotban. . A T-helper limfocitákon kívül a makrofágok, a B-limfociták is érintettek. a neuroglia sejtjei, a bélnyálkahártya és néhány más sejt. A T-limfociták (CD4 sejtek) számának csökkenésének oka nemcsak a vírus közvetlen citopátiás hatása, hanem a nem fertőzött sejtekkel való egyesülésük is. A HIV-fertőzött betegek T-limfocitáinak vereségével együtt a B-limfociták poliklonális aktiválódása következik be, minden osztályba tartozó immunglobulinok, különösen az IgG és IgA szintézisének növekedésével, és az immunrendszer ezen részének kimerülésével. rendszer. Az immunfolyamatok szabályozásának zavara az alfa-interferon, a béta-2-mikroglobulin a szintjének növekedésében és az interleukin-2 szintjének csökkenésében is megnyilvánul. Az immunrendszer működési zavara következtében, különösen akkor, ha a T-limfociták (CD4) száma 400 vagy kevesebb sejtre csökken 1 μl vérben, a HIV kontrollálatlan replikációjának feltételei alakulnak ki, a virionok számának jelentős növekedésével a különböző sejtekben. a test környezetei. Az immunrendszer számos részének veresége következtében a HIV-fertőzött személy védtelenné válik a kórokozókkal szemben. különféle fertőzések... A fokozódó immunszuppresszió előcsarnokában olyan súlyos, progresszív betegségek alakulnak ki, amelyek normálisan működő emberben nem fordulnak elő. az immunrendszert... Ezeket a betegségeket a WHO AIDS markerként (indikátorként) határozza meg.
Az első csoport - olyan betegségek, amelyek csak súlyos immunhiányban rejlenek (a CD4-szám 200 alatt van). A klinikai diagnózist HIV-ellenes antitestek vagy HIV antigének hiányában végzik.
A második csoport - a háttérben kialakuló betegségek súlyos immunhiány, és bizonyos esetekben anélkül is. Ezért ilyen esetekben a diagnózis laboratóriumi megerősítése szükséges.

Laboratóriumi diagnosztika

UDC -078

Vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája

N.N. Kiöntő, V.M. Sztahanov

nevét viselő Virológiai Intézet DI. Ivanovsky RAMS, Moszkva

Vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája

N.N. Nosik, V.M. Stachanova

Bevezetés

A vírusos betegségek kezelésének és megelőzésének lehetőségeinek bővülése vírusellenes gyógyszerekkel, immunmodulátorokkal és különböző hatásmechanizmusú vakcinákkal gyors és pontos laboratóriumi diagnosztikát igényel. Egyes vírusellenes gyógyszerek szűk specifitása a fertőző ágens gyors és nagyon specifikus diagnosztizálását is megköveteli. Kvantitatív módszerekre van szükség a vírusok meghatározására az antivirális terápia monitorozására. A járványellenes intézkedések megszervezésében a betegség etiológiájának megállapítása mellett fontos a laboratóriumi diagnosztika.

A járványos fertőzések első eseteinek korai diagnosztizálása lehetővé teszi a járványellenes intézkedések – karantén, kórházi kezelés, védőoltás stb. – időben történő végrehajtását. A fertőző betegségek, például a himlő felszámolására irányuló programok végrehajtása megmutatta, hogy végrehajtásuk során fontos szerepet játszik a laboratóriumi diagnosztika növekszik. A vérszolgálatban és a szülészeti gyakorlatban fontos szerepet játszik a laboratóriumi diagnosztika, például a fertőzött donorok azonosítása. humán immunhiány vírus(HIV), hepatitis B vírus (HBV), rubeola és citomegalovírus fertőzés diagnózisa terhes nőknél.

Diagnosztikai módszerek

A vírusfertőzések laboratóriumi diagnózisának három fő megközelítése létezik (1. táblázat, 2. táblázat):

1) az anyag közvetlen vizsgálata vírusantigén vagy nukleinsav jelenlétére;

2) a vírus izolálása és azonosítása klinikai anyagból;

3) szerológiai diagnosztika, amely a vírusos antitestek számottevő növekedésének megállapításán alapul a betegség lefolyása során.

A vírusdiagnosztika bármely választott megközelítése esetén az egyik legfontosabb tényező a vizsgált anyag minősége. Így például egy minta közvetlen elemzéséhez vagy egy vírus izolálásához a vizsgálati anyagot a betegség legelején kell beszerezni, amikor a kórokozó még viszonylag nagy mennyiségben ürül, és még nem kötődik antitestekhez, és a minta térfogatának elegendőnek kell lennie a közvetlen kutatáshoz. Fontos az is, hogy az anyagot az állítólagos betegségnek megfelelően válasszuk ki, vagyis azt az anyagot, amelyben a fertőzés patogenezise alapján a legnagyobb a vírus jelenlétének valószínűsége.

A sikeres diagnosztikában fontos szerepet játszik az anyag felvételének, szállításának és tárolásának a környezete. Tehát a nasopharyngealis vagy rektális keneteknél a vezikulák tartalmát olyan fehérjét tartalmazó táptalajba helyezzük, amely megakadályozza a vírus fertőzőképességének gyors elvesztését (ha az izolálást tervezik), vagy megfelelő pufferbe (ha az tervezett nukleinsavakkal való munka).

Közvetlen módszerek a klinikai anyag diagnosztizálására

A közvetlen módszerek olyan módszerek, amelyek vírust, vírusantigént vagy vírust mutatnak ki nukleinsav(NC) közvetlenül a klinikai anyagban, vagyis ezek a leggyorsabbak (2-24 óra). A kórokozók számos sajátossága miatt azonban a direkt módszereknek megvannak a maguk korlátai (hamis pozitív és álnegatív eredmények elérésének lehetősége). Ezért ezek gyakran közvetett módszerekkel történő megerősítést igényelnek.

Elektronmikroszkópia (EM). Ezzel a módszerrel észlelheti a tényleges vírust. A vírus sikeres meghatározásához a mintában lévő koncentrációja körülbelül 1 · 10 6 részecske legyen 1 ml-ben. De mivel a kórokozó koncentrációja a betegek anyagában általában jelentéktelen, a vírus keresése nehéz, és előzetes kicsapást igényel nagy sebességű centrifugálással, majd negatív kontraszttal. Ezenkívül az EM nem teszi lehetővé a vírusok tipizálását, mivel sok közülük nincs morfológiai különbség a családon belül. Például a herpes simplex, cytomegaly vagy herpes zoster vírusok morfológiailag gyakorlatilag megkülönböztethetetlenek.

A diagnosztikai célokra használt EM-változatok egyike az immunelektronmikroszkópia(IEM), amely vírusok elleni specifikus antitesteket használ. Az antitestek vírusokkal való kölcsönhatásának eredményeként komplexek képződnek, amelyek negatív kontrasztozás után könnyebben kimutathatók.

Az IEM valamivel érzékenyebb, mint az EM, és olyan esetekben használják, amikor a vírus nem tenyészthető in vitro például a vírusos hepatitis kórokozóinak keresése során.

Immunfluoreszcens reakció (RIF). Az eljárás színezékhez, például fluoreszcein-izotiocianáthoz kötött antitestek alkalmazásán alapul. A RIF-et széles körben használják a vírusantigének kimutatására a betegek anyagában és a gyors diagnózis érdekében.

A gyakorlatban két RIF opciót használnak: egyenesés közvetett... Az első esetben a vírusok elleni festékkel jelölt antitesteket alkalmazzák, amelyeket a fertőzött sejtekre visznek fel (kenet, sejttenyészet). Így a reakció egy lépésben megy végbe. Ennek a módszernek az a hátránya, hogy sok vírushoz nagy számú konjugált specifikus szérumra van szükség.

A RIF indirekt változatában egy specifikus szérumot visznek fel a vizsgált anyagra, amelynek antitestei az anyagban lévő vírusantigénhez kötődnek, majd egy fajellenes szérumot rétegezünk az állat gamma-globulinjaira, amelyben a specifikus immunszérumot készítettek, például anti-nyúl, anti-ló stb. A RIF indirekt változatának előnye, hogy csak egyfajta jelölt antitestre van szükség.

A RIF módszert széles körben alkalmazzák az akut légúti vírusfertőzések etiológiájának gyors megfejtésére a felső nyálkahártyájáról származó kenetlenyomatok elemzése során. légutak... A RIF sikeres alkalmazása egy vírus közvetlen kimutatására klinikai anyagban csak akkor lehetséges, ha kellően nagy számú fertőzött sejtet tartalmaz, és enyhe szennyeződést okoz a nem specifikus lumineszcenciát produkáló mikroorganizmusokkal.

Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA). A vírusantigének meghatározására szolgáló, enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatok elvileg hasonlóak a RIF-hez, de az antitestek enzimekkel, nem pedig színezékekkel való jelölésén alapulnak. A legelterjedtebb a torma-peroxidáz és az alkalikus foszfatáz, valamint a -galaktozidáz és a -laktamáz. A jelölt antitestek kötődnek az antigénhez, és az ilyen komplexet az enzim szubsztrátjának hozzáadásával mutatják ki, amelyhez az antitestek konjugálva vannak. A reakció végterméke lehet oldhatatlan csapadék, majd az elszámolás hagyományos fénymikroszkóppal, vagy oldható termék formájában történik, amely általában színezett (vagy fluoreszkálhat, lumineszcálhat) ill. hangszeresen rögzítik.

Mivel az ELISA képes mérni az oldható antigéneket, nincs szükség ép sejtekre a mintában, így különböző típusú klinikai anyagok használhatók.

Az ELISA-módszer másik fontos előnye az antigének mennyiségi meghatározásának képessége, amely lehetővé teszi annak értékelését. klinikai lefolyás betegség és a kemoterápia hatékonysága. Az ELISA a RIF-hez hasonlóan közvetlen és közvetett változatban is használható.

A szilárd fázisú ELISA-t használják legszélesebb körben, amely oldható színes reakcióterméket ad. Az ELISA mind az antigén meghatározására (majd az antitesteket a szilárd fázisra - a polisztirol lemez lyukának aljára) alkalmazza, mind az antitestek meghatározására (majd az antigéneket a szilárd fázisra alkalmazza).

Radioimmunoassay (RIA) ... A módszer az antitestek radioizotópokkal történő jelölésén alapul, amelyek nagy érzékenységet biztosítottak a vírusantigén meghatározásában. A módszer a 80-as években terjedt el, különösen a HBV és más tenyészthetetlen vírusok markereinek meghatározására. A módszer hátrányai közé tartozik a radioaktív anyagokkal való munka szükségessége és a drága berendezések (gammaszámlálók) használata.

Molekuláris módszerek. Kezdetben a vírusgenom kimutatásának klasszikus módszerét az NK-hibridizáció rendkívül specifikus módszerének tekintették, manapság azonban a vírusgenomok izolálása a polimeráz láncreakció(PCR).

Nukleinsavak molekuláris hibridizációja. A módszer a komplementer DNS- vagy RNS-szálak hibridizációján, kettős szálú struktúrák kialakításán, valamint jelöléssel történő azonosításán alapul. Erre a célra speciális, izotóppal (32 P) vagy biotinnal jelölt DNS- vagy RNS-próbákat használnak, amelyek a DNS vagy RNS komplementer szálait detektálják. A módszernek több változata is létezik: - ponthibridizáció - izolált és denaturált NC-ket viszünk fel szűrőkre, majd egy jelölt próbát adunk hozzá; az eredmények jelzése - autoradiográfia 32 P vagy festés esetén - avidin-biotinnal; - blot hibridizáció - eljárás restrikciós endonukleázokkal kivágott NK-fragmensek izolálására a teljes DNS-ből, és nitrocellulóz szűrőkre vittük át, és jelölt próbákkal tesztelték; HIV-fertőzés megerősítő tesztjeként használják; - hibridizáció in situ- lehetővé teszi az NK meghatározását a fertőzött sejtekben.

PCR a természetes DNS-replikáció elvén alapul. A módszer lényege a vírusspecifikus DNS-szekvencia szintézis (amplifikáció) ciklusainak ismételt megismétlésében rejlik, hőstabil Taq DNS polimeráz és két specifikus primer - az úgynevezett primerek - felhasználásával.

Minden ciklus három szakaszból áll, különböző hőmérsékleti feltételekkel. Minden ciklusban megduplázódik a szintetizált szakasz másolatainak száma. Az újonnan szintetizált DNS-fragmensek templátként szolgálnak az új szálak szintéziséhez a következő amplifikációs ciklusban, amely 25-35 ciklust tesz lehetővé a kiválasztott DNS-régió megfelelő számú másolatának előállításához annak meghatározásához, általában agaróz gélelektroforézissel.

A módszer nagyon specifikus és nagyon érzékeny. Lehetővé teszi a vírus DNS több másolatának kimutatását a vizsgálati anyagban. Az utóbbi években a PCR-t egyre inkább alkalmazzák vírusfertőzések (hepatitis vírusok, herpesz, citomegalia, papilloma stb.) diagnosztizálására és monitorozására.

Kidolgozták a kvantitatív PCR egy olyan változatát, amely lehetővé teszi az amplifikált DNS-hely kópiák számának meghatározását. A technika bonyolult, drága és még nem kellően szabványosított a rutinszerű használatra.

Citológiai módszerek jelenleg korlátozott diagnosztikai értékkel bírnak, de számos fertőzés esetén továbbra is használhatók. Megvizsgálják a boncolás, biopszia, kenet anyagokat, amelyeket megfelelő feldolgozás után megfestenek és mikroszkóp alatt elemeznek. Citomegalovírus fertőzés esetén például a szövetmetszetekben vagy a vizeletben jellegzetes óriássejtek - "bagolyszem", veszettség esetén - zárványok találhatók a sejtek citoplazmájában (Babesh-Negri kis testei). Egyes esetekben, például a krónikus hepatitis differenciáldiagnózisában, fontos a májszövet állapotának felmérése.